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影响电泳分离的主要因素

影响电泳分离的主要因素

 1. 待分离生物大分子的性质:待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和 性质都会对电泳有明显影响。一般来说,子带的电荷量越大、直径越小、形状 越接近球形,则其电泳迁移速度越快。

2. 缓冲液的性质:缓冲液的 pH 值会影响待分离生物大分子的解离程度, 从而对其带电性质产生影响,溶液 pH 值距离其等电点愈远,其所带净电荷量 就越大,电泳的速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液 pH 还会 影响到其电泳方向,当缓冲液 pH 大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负 电荷, 其电泳的方向是指向正极。 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电 荷以及缓冲液 pH 值的稳定性, 缓冲液通常要保持一定的离子强度, 一般在 0.02 -0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在待分离分 子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛) ,由于离子氛与待分 离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。 另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。

3. 电场强度:电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电 场强度越大, 电泳速度越快。 但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大, 而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为:W=I2.R.t 式中:I 为电流强度,R 为电阻,t 为电泳时间。 电流所作的功绝大部分都转换为热, 因而引起介质温度升高, 这会造成很 多影响: 1、 样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的加宽; 2、 产生对流,引起待分离物的混合; 3、 如果样品对热敏感,会引起蛋白变性; 4、 引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周 散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央 部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于 中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度, 可以减小生热, 但会延长电泳时间, 引起待分离生物大分子扩散的增加而影响 分离效果。 所以电泳实验中要选择适当的电场强度, 同时可以适当冷却降低温 度以获得较好的分离效果。

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